荧光定量PCR系统中的荧光检测研究

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3.0 陈辉 2024-11-19 4 4 1.04MB 59 页 15积分

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第一章绪论

§1.1 课题研究背景及意义

维护人类健康，提高全民健康水平，加强对重大疾病及疫情的预防与控制，

这些都离不开生命科学和医学的发展。现代化的生命科学和医用分析仪器的发展

为生命科学和医学的研究提供了强有力的手段。使其研究水平从细胞飞跃发展到

分子层次上。离开这些现代化生命科学仪器的支撑，许多重大的科学研究项目和

工程都将举步维艰。

聚合酶链反应（polymerase chain reaction）简称 PCR，它是一项在短时间内体

外大量扩增特定 DNA 片段的分子生物技术。PCR 技术通过体外酶促反应选择性地

合成特异性 DNA，其原理类似于天然 DNA 的复制，实现了基因扩增从体内到体

外的飞跃。反应步骤是人工合成一对寡核苷酸引物与特异扩增 DNA 片段两条链的

两端序列分别互补，由高温热变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，循环进

行，使 DNA 片段得以迅速扩增。

PCR 技术由美国 PE-Cetus 公司的科学家 Kary Mullis 发明，他从 1983 年开始

研究 PCR 技术，1985 年以后，PCR 迅速成为分子生物学的一项常规手段，得到了

广泛应用，被视为 DNA 双螺旋结构发现以来分子生物学领域最重要的一项技术突

破，1993 年，Mullis 因此获得诺贝尔化学奖。

本课题研究为上海市教委项目—“荧光定量基因检测系统研究”组成部分，

主要研究荧光定量 PCR 系统中的荧光检测部分。包括试验测定 PCR 反应荧光特性，

建立 PCR 荧光检测体系和装置，并利用激光诱导荧光（LIF）和荧光共振能量转移

（FRET）理论对 PCR 荧光检测的精确性、可靠性等进行量值溯源分析。

目前，基于 PCR 原理和荧光技术而研制的各种荧光定量 PCR 检测系统使用的

荧光定量技术多种多样。由于各种 PCR 技术使用的标记物不同，荧光度的参比样

品不同，各种荧光检测的量值不统一等等，使许多实验结果不好对比，量值混乱。

这直接影响到生物 PCR 产品使用的可靠性、推广性、实验结果的社会认可以及产

业化生产过程中的质量控制。

为了促进生物学由实验性学科向精确定量性学科发展，以计量学的量值溯源

理念在生物学中开展有关研究是符合由于 DNA 重组技术的成熟使生物学飞速发展

的大趋势的。目前，结合我国国情和我国拥有自主知识产权的生物工程研究以及

制品的发展情况，创立拥有我国自主知识产权的 PCR 荧光检测研究体系和研究装

置是具有十分重要意义的。

荧光定量 PCR 系统中的荧光检测研究

§1.1.1 聚合酶链反应（PCR）技术的原理和方法

一．PCR的基本原理

PCR 的基本工作原理[1]是以单链或双链 DNA (ssDNA, dsDNA) 为模板，以一

对分别与模板序列互补的寡核苷酸片段为引物，在以脱氧核糖三磷酸 (dNTP) 为

核苷原料的适当 Mg2+浓度的缓冲溶液中，在热稳定 DNA 聚合酶的作用下，通过

设置温度循环，进行链式反应达到大量合成模板 DNA 的目的。在合适条件下，这

种循环不断重复，前一个循环的产物 DNA 可作为后一个循环的模板 DNA 参与合

成，使产物 DNA 的量按 2n方式扩增。从理论上讲，经过 30 次的循环反应，DNA

扩增倍数为 106~109。因此，能用微量样品获取目的基因。

其中每个循环主要由三个步骤组成：○

1变性 (denaturation)，通常在 95℃条件

下进行，使模板 DNA 完全变性成单链；○

2复性 (annealing)，降至适宜温度，使引

物与模板 DNA 退火结合；

○

3延伸 (extension)，将温度升高，通常约为 72℃，以便

dNTP 合成新生 DNA 链延伸。

（一）变性

变性的目的是要使双链 DNA 模板完全解链成单链。原则上变性步骤要高温、

短时，既要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。若变性不充分，

DNA 双链会很快恢复，PCR 产物就会明显减少；反之，变性温度过高、时间过长，

会加快酶的失活。

双链 DNA 模板的变性温度由其 G+C 含量决定，dsDNA 的G+C 含量越高，解

链温度也越高。变性的时间是由 dsDNA 分子的长度来决定的，分子长度越大，两

条链完全分开所需的时间也越长。典型的变性条件是 95℃，时间 30s，对 G+C 含

量多的靶 DNA 序列宜用较高的变性温度。在解链温度（Tm）下，DNA 的变性仅

需几秒钟。Tm值可根据靶 DNA 中G+C 含量，按下述公式来计算[2]，

mT 81.5 16.6lg[Na ]+0.41(G+C)% 600/N  

(1.1)

其中 N为链长。

（二）复性

复性（或称退火）的作用是使模板 DNA 单链或上一轮的反应产物与引物相结

合。复性温度（Ta）是指引物与模板特异结合的最佳温度，是任何 PCR 反应最重

要的参数。引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应成分

中的浓度。复性温度（Ta）过高，引物不能与模板很好的复性，扩增效率很低；复

性温度（Ta）太低，引物将产生非特异性复性，导致非特异性的 DNA 片段的扩增。

虽然 Ta可以通过理论计算出来，但无法找到一个普适公式，来适用于所有长度和

不同序列的寡核苷酸引物。通常退火温度比引物的解链温度（Tm）低 5℃，一般用

第一章绪论

37-55℃或高一点，时间 1min。

（三）延伸

引物延伸即寡核苷酸引物的延长，是 DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到

引物 3’末端，依据模板序列合成一条互补新链的过程。引物延伸温度取决于 DNA

聚合酶的最适温度。如用 Taq DNA 聚合酶，一般用 72-78℃；在 72℃时，其聚合

速率约为 2000bp/min。延伸时间取决于靶序列的长度、浓度和延伸温度，一般为

1-3min。靶序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；反之，

所需的延伸时间越短。在相同的延伸温度下，循环早期因靶序列即酶的底物浓度

低，延伸时间要长些。在循环后期，当 PCR 产物的浓度超过酶的浓度（1nmol/L）

时，酶被底物饱和，为了增加酶的周转利用，延伸时间也要长些。一般每 1000bp

碱基的序列，延伸 1min 即可。对于扩增 100-300 个碱基的短序列片段，省去延伸

温度这一步骤而采用快速简便的变性、退火双温循环也是实验中常见的。因为 Taq

DNA 聚合酶即使在变性温度下仍保持很强的酶活性，而延伸过程可在退火温度转

变为变性温度的过程中完成。

在设定上述反应温度与时间参数时，还应考虑所用 PCR 仪从一种温度转变到

另一种温度所需的过渡时间，反应离心管管壁的厚薄不同而造成的管内温度滞后

等情况。

（四）循环次数

循环次数即 DNA 双链高温变性、引物退火和新链延伸这三个步骤反复循环的

次数，通常需要 25-40 个。若 PCR 反应中各项参数适宜，其扩增循环次数主要取

决于反应体系中起始的模板拷贝数，还与引物延伸和扩增的效率有关。循环次数

过多，产物相应增多，但会增加非特异性产物的量及其复杂度；循环次数过少，

会降低 PCR 产量。对于 Taq DNA 聚合酶，在一个含有拷贝数为 105的靶序列的反

应体系中进行 30 次循环后就能到达理想扩增情况，即进入几何级数增长期，反应

会一直进行下去，直至某些成分耗尽而反应的限制因素。

二．PCR的反应体系

上述的聚合酶链反应是在特定的 PCR 反应体系中进行的，主要包括以下六种

成分：

（一）模板 DNA

模板 DNA 是待扩增的核酸系列。PCR 反应的模板可以是单链或双链 DNA

(ssDNA, dsDNA)，也可以是基因组 DNA、质粒 DNA、cDNA、mRNA 等几乎所有

形式的 DNA 和RNA。mRNA 可作为 PCR 的模板，只需用逆转录酶把 mRNA 逆

荧光定量 PCR 系统中的荧光检测研究

转录为 cDNA 即可。由于 PCR 反应的特异性由寡聚核苷酸引物决定，模板 DNA

不需要高度纯化，但应避免任何蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂、能结合 DNA

的蛋白质及多糖类物质的污染。选用纯化的 DNA 做模板，可增加模板分子的浓度，

可显著提高 PCR 扩增的有效性。通常，模板 DNA 保存于 10mmol/L Tris-HCl

（pH7.6）、10mmol/L EDTA（pH8.0）缓冲液中。除了纯化的 DNA 外，PCR 反应

还可以直接以细胞为模板。

PCR 所需模板 DNA 的量极微（一般为纳克级），通常适宜的模板 DNA 浓度

为30-50ng，不到 1ng 的基因组 DNA 序列就足以用来进行 PCR 分析，甚至单个

DNA 分子就能扩增出特定的 DNA 序列。

（二）引物

PCR 引物是一段与待扩增的靶 DNA 序列的 3’端和 5’端特异性结合的寡核苷

酸片段，长度大多为 10-30 个核苷酸长度，是决定 PCR 特异性的关键。通常，一

对引物包含 5’端与正义链互补的寡核苷酸片段和 3’端与反义链互补的寡核苷酸片

段，它们在模板 DNA 上的结合位置之间的距离决定 PCR 扩增片段的长度。

PCR 反应成功的关键是设计最佳的引物。引物设计的先决条件是与引物结合

的靶 DNA 序列必须是已知的，与两个引物结合的序列之间的靶 DNA 序列则未必

清楚。一般来说，引物越长，对于靶序列的特异性也越高。以下公式[2]可以计算一

段寡核苷酸与一条线性的随机排列的 DNA 序列中的某一段完全配对的概率，

G+C A+T

[ / 2] [(1 ) / 2]K g g  

(1.2)

式中，K是该寡核苷酸出现在 DNA 序列中的频率；G、C、A、T是特定的寡核苷

酸中相应得核苷酸的数目；g是该 DNA 序列中的 G+C 含量。

一般情况下，设计引物时，G+C 碱基对含量以 40%-60%为佳，4种碱基要分

配均匀。两个引物中 G+C 碱基对的百分比(G+C)%应尽量相似，若待扩增序列中

G+C 含量已知时，引物的 G+C 含量则应与其类似。引物的长度一般为 18-25 个核

苷酸长度，不能有大于 3bp 的反向重复序列或自身互补序列存在；上下游引物的

长度差别不能大于 3bp，两个引物的解链温度（Tm）相差不能大于 5℃；同时避免

引物自身形成发夹结构等二级结构，两个引物之间不应存在互补序列，尤其是在

引物的 3’末端，即使无法避免，其 3’端的互补碱基也不能多于 2个，以减少引物

二聚体的形成。否则会影响靶 DNA 序列的扩增。在合成新链时，DNA 聚合酶将

单核苷酸添加到引物的 3’末端，因此引物 3’端的 5-6 个碱基与靶 DNA 片段的配对

必须精确、严格。

由于引物设计涉及的因素较多，为了优化引物设计，常常借助 PCR 引物设计

软件进行计算机程序辅助设计，然后由专业的生物技术公司用 DNA 合成仪合成。

第一章绪论

合成的寡核苷酸引物一般用层析法或聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯化，纯化的引

物在 25%乙腈溶液中 4℃下短暂保存或在-20℃下中长期保存，冻干后则可保存 1

年以上。

在PCR 反应中，引物的适宜浓度为 0.2～1μmol/L。引物浓度过高，容易形成

非特异性扩增，引物浓度过低，不足以完成 30 个循环，降低 PCR 的产量。通常模

板DNA 的量较多或高度复杂 DNA 如人类基因组 DNA 作模板时，引物浓度应低

一些；模板 DNA 的量较少或低度复杂 DNA 如质粒 DNA 作模板时，引物浓度应

高一些。

（三）DNA 聚合酶

热稳定 DNA 聚合酶是 PCR 技术实现自动化的关键[3]。最初的 DNA 聚合酶是

从大肠杆菌中提取的 DNA 聚合酶 A的Klenow 片段。该片段具有聚合酶活性和 3’→

5’外切核酸酶活性，能识别和消除错配的引物末端，以校正复制过程中错配的核苷

酸。但 Klenow 片段对热敏感，DNA 变性温度即可使酶失活，因此在 PCR 的变性

步骤后都必须重新加聚合酶，造成 PCR 技术操作十分烦琐、耗时费力、反应低效

及费用增加。

后来，又从温泉中发现的嗜热菌中分离出 Taq（T.aquaticus）DNA 聚合酶，

该酶基因全长 2496 个碱基，编码 832 个氨基酸。由于这些聚合酶具有 95℃以上的

耐热性，只需在 PCR 反应开始时加一次聚合酶，就能在整个 PCR 循环中保持酶活

性，大大简化了 PCR 操作程序，提高了 PCR 扩增效力、省时省力，从而使 PCR

技术得到了进一步完善。目前，商品化的 Taq DNA 聚合酶均为基因重组技术生产

并在 PCR 反应中广为应用。

由于水生栖热菌在 70-75℃下最适生长，因此 72℃被认为是 Taq DNA 聚合酶

合成 DNA 的最适温度，每个酶分子与核苷酸的结合率每秒近 150 个核苷酸。在高

温条件下，Taq DNA 聚合酶仍然具有较高的酶活性，不会发生不可逆变性。在

92.5℃、95℃和 97.5℃时，PCR 反应中的 Taq DNA 聚合酶分别经过 130min、40min

和5min 后仍可保持 50%左右的酶活性。因此在实际操作时选用的变性温度以

92-94℃较为适宜，不宜高于 95℃。

在100μL 的PCR 标准反应体系中，Taq DNA 聚合酶的常用浓度为 1-2.5U，人

类基因组 DNA 作模板时，Taq DNA 聚合酶的适宜浓度范围为 1-4U。酶量过多会

导致增加非特异性 PCR 产物，反之会引起 PCR 产量不足。Taq DNA 聚合酶作用

时需要 Mg2+，每次扩增反应必须确定最佳 Mg2+浓度。

（四）脱氧核糖三磷酸(dNTP)

4种等摩尔浓度的脱氧核糖三磷酸（dATP、dTTP、dCTP 和dGTP）是 PCR

荧光定量 PCR 系统中的荧光检测研究

反应体系中靶 DNA 序列扩增的原料。在 PCR 反应中每种脱氧核苷三磷酸的浓度

以50-200μmol/L 为宜，不能低于 10-15μmol/L。浓度过高易引起非特异性 PCR 产

物，当 dNTP 浓度高于 4mmol/L 时还会抑制 Taq 酶的活性；浓度过低则影响扩增

产量。4种dNTP 的摩尔浓度应相同，不平衡的浓度会导致碱基错配率上升，降低

合成速度，导致反应过早终止。在 100μL 的标准反应体系中，浓度 50μmol/L 和

200μmol/L 的dNTP 就足以分别合成 6.550-200μg 和25μgDNA。

（五）缓冲液

要保证 PCR 反应体系的 pH，必须用 Tris-HCl 缓冲液，室温下，PCR 缓冲液

的pH 值调至 8.3-8.8 之间。标准缓冲液通常含有 10mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L KCl，

和1.5mmol/L MgCl2。一般购买的 10×PCR 缓冲液分含 Mg2+和不含 Mg2+两种，不

含Mg2+的缓冲液，其 25mmol/L MgCl2单独包装，使用时再自行配制。

（六）阳离子

由于热稳定 DNA 聚合酶均要求有游离的二价阳离子，因此 PCR 反应体系中

Mg2+的浓度十分重要，适宜的 Mg2+浓度为高于 dNTP 总浓度 0.5-2.5mmol/L。当

dNTP 浓度为 0.2mmol/L 时，建议 Mg2+的浓度为 1mmol/L。Mg2+浓度过高，容易

生成非特异性扩增产物；反之，浓度过低会使 PCR 产量降低。

标准缓冲液通常含有 50mmol/L KCl，这对于扩增大于 500bp 长度的 DNA 片

段是有益的，提高 KCl 浓度到 70-100mmol/L，对于改善扩增较短长度的 DNA 片

段也是有益的。

§1.1.2 聚合酶链反应（PCR）结果的检测与分析

PCR 反应进行若干循环后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩

增产物及产物的特异性。伴随着 PCR 技术的发展，已经产生了许多检测分析 PCR

扩增产物的方法[3]。包括凝胶电泳、高效液相色谱、核酸探针杂交、酶免疫分析、

限制性内切酶分析、单链构象多态性分析、核酸序列分析、荧光定量分析等。

其中凝胶电泳是早期检测 PCR 扩增产物最常用的方法之一。当时几乎所有的

核酸实验都需要进行凝胶电泳，它是分离、鉴定和提纯 DNA 的标准方法之一。限

制性内切酶分析及核酸杂交分析都是在凝胶电泳基础上进行的。电泳的基本原理

是按分子量大小分离核酸，其操作相对简单。凝胶电泳检测 PCR 扩增产物，能迅

速确定有无预期的扩增产物以及扩增产物的分子量大小。例如采用溴化乙锭（EB）

染色凝胶中的 DNA，直接在紫外光下观察，可检测出凝胶中最少 1ng 的DNA。下

面选其中若干代表性技术作简单介绍。

一．凝胶电泳

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