基于荧光显微镜的单细胞捕获系统

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3.0 侯斌 2024-11-19 4 4 3.17MB 58 页 15积分

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摘要

在医学工程领域，需要在显微镜下对许多微小的生物细胞操作，比如快速识

别、分选、捕获细胞。现行的大多数操作还是人工操作，效率低。由于全自动显

微操作系统大多数为进口，价格昂贵，无法普及使用。本文围绕显微操作的自动

化和智能化的主题，设计了基于荧光显微镜的用于识别捕获红细胞的计算机控制

的自动化显微操作系统，该系统相对于进口系统成本较低，并且利用光机电技术

结合实现稳定性好、可重复性高的自动化细胞操作。

本文主要针对生物倒置显微镜结合的成像原理，根据显微操作系统的结构和

特点，对各个部件进行选型，选择合适的机械定位系统和显微视觉系统，将各部

件及其驱动器连接到正确端口构建自动化显微操作系统。其次，本文还研究了视

觉反馈系统的图像处理算法，包括利用对焦深度法控制显微镜自动聚焦，并通过

图像清晰度评价函数进行验证。基于显微视觉伺服技术，应用采用机器学习的

Dapple 算法识别细胞并控制平台，比传统的简单光强度阈值判断识别细胞算法更

稳健。进而，在此基础上，本文基于 Micro-Manager 显微镜软件的框架，设计了

一套针对全自动细胞识别捕获的软件系统，编写了 XY 移动平台以及 Z轴精密电

镜的可视化控制以及自动化脚本控制。使用 PID 控制器与视觉反馈结合,实现了

XY 二维平台、精密长轴以及 Z轴物镜电机等执行元件的精密控制，XY 平台的

精度可达 0.1um，Z轴物镜电机的步进量可达 100nm。最后，对整体系统进行分

析，并提出了发展和改进的方向。

本文完成了对系统进行样机设计，大部分指标达到了设计指标的要求，并且

图像识别速度以及识别率可以与进口产品进行媲美，成本却大大降低，是国外产

品的 1/10，具有较大的市场竞争力。

关键词：荧光显微镜显微操作细胞识别

ABSTRACT

In the field of medical engineering, under a microscope need many tiny organisms

operation, such as rapid identification, sorting and cells captured. Because most of

automated microscopy operation system cost high, the majority of the existing operation

is manual operation with low efficiency. This paper focuses on automated

micromanipulation. We developed a set of computer-controlled automated

micromanipulation system based on fluorescent microscope, using optical and electrical

technologies to achieve good stability, high repeatability of automated cell operation.

This paper analyzes the present situation of micromanipulation, and then put the

significance of this project for bio-imaging principle inverted microscope combined,

according to the microscopic structure and characteristics of the operating system,

choose the appropriate components and all of them are connected to the correct port to

build automated micromanipulation systems. Secondly, this paper, the image processing

algorithms visual feedback system, including the use of law to control the depth of

focus microscope auto-focus, image sharpness and validated by the evaluation function.

Based on microscopic visual servo technology, applications Dapple uses machine

learning algorithms to identify the cells and control platform than the traditional light

intensity threshold determination simple cell recognition algorithm is more robust.

Furthermore, on this basis, the paper frame Micro-Manager software-based microscope,

designed a fully automated cell recognition software system for capturing, written and

visual control automation scripts to control XY and Z-axis precision mobile platforms

electron microscopy. Using a PID controller and visual feedback, the system achieved a

precise control of two-dimensional XY platform, precision and micro-pumps and other

long axis of the actuator. Finally, by comparing with the manual operation of the

machine, to verify the proper selection and control scheme vision algorithms, automated

micromanipulation with good stability, high repeatability and low cost advantages.

This paper completed the design of the system prototype, meet the design

requirements of indicators, and image recognition speed and recognition rate can be

comparable with imported products, the cost is greatly reduced , has a large market

competitiveness.

Keywords: fluorescent microscope, micromanipulation, cell

recognition

摘要

ABSTRACT

1.1 引言 ........................................................... 1

1.1.1 研究背景 ................................................... 1

1.1.2 研究意义 ................................................... 2

1.2 显微操作系统的研究现状 ......................................... 3

1.2.1 国外研究现状 ............................................... 4

1.2.2 国内研究现状 ............................................... 7

1.3 课题的来源与意义 ............................................... 7

1.4 本文主要研究工作 ............................................... 8

1.5 本章小结 ....................................................... 8

第二章单细胞捕获系统的系统组成 .................................... 9

2.1 引言 ........................................................... 9

2.2 系统的设计要求 ................................................. 9

2.3 系统的组成 .................................................... 12

2.3.1 显微镜机架选型 ............................................ 12

2.3.2 激发光源 .................................................. 13

2.3.3 染料 ...................................................... 14

2.3.4 荧光滤色片 ................................................ 15

2.3.5 自动调焦闭环系统构成 ...................................... 17

2.3.6 探测器 .................................................... 18

2.3.7 机械定位系统 .............................................. 19

2.3.5.1 XY 精密移动平台 ........................................ 20

2.3.5.2 精密电动长轴 .......................................... 22

2.4 本章小结 ...................................................... 22

第三章视觉反馈系统的图像处理 ...................................... 23

3.1 引言 .......................................................... 23

3.2 视觉反馈系统分析 .............................................. 23

3.3 自动对焦 ...................................................... 25

3.3.1 自动调焦的几种方法 ........................................ 25

3.3.2 采用的自动调焦方法以及实现 ................................ 26

3.4 荧光图像处理 .................................................. 30

3.4.1 噪声的滤除 ................................................ 30

3.4.2 荧光细胞的定位 ............................................ 33

3.5 本章小结 ...................................................... 39

第四章机械控制系统的软件设计 ...................................... 40

4.1 引言 .......................................................... 40

4.2 总体控制方案 .................................................. 40

4.3 显微软件框架 MICRO-MANAGER 的介绍 ................................ 41

4.4 精密平台和自动调焦物镜的机械控制 .............................. 42

4.4.1 XY 精密移动平台的驱动 ..................................... 42

4.4.2 Z 轴精密马达的驱动 ........................................ 44

4.5 定位系统的机械自动控制 ........................................ 46

4.6 本章小结 ...................................................... 49

第五章总结与展望 .................................................. 50

5.1 本文总结 ...................................................... 50

5.2 展望 .......................................................... 50

参考文献 ........................................................... 51

致谢 ............................................................... 56

第一章绪论

1.1 引言

1.1.1 研究背景

近年来生物科学技术得到了飞速发展，海内外学者对应用于单细胞的显微操

控技术在医用方面的相关研究日益加深。众所周知，细胞是构成生物体的基本单

元和行使功能的单位，从而自然地成为生物科技中的重点研究对象。早在 19 世

纪的 30 年代，MJ. Schleiden 和T. Schwann 就建立了完整的细胞学说。以细胞与

亚细胞层面为基础，研究人员对细胞的结构以及细胞的活动规律进行了详尽的研

究。这些研究包含如细胞培养(Cell Culture)、细胞融合(Cell Fusion)和细胞核移植

(Nuclear Transfer)等[1-4]。

细胞工程的操控对象即为细胞，而细胞的尺度相当细微，其尺度的数量级一

般为微米量级，更有甚者可以达到纳米量级。面对这种极其细微尺度的操作，细

胞生物研究者需要具有相当的技术水平。鉴于这种实际的应用需求，海内外现有

的成熟的显微操作系统大都应用于生物医学等相关的研究领域。

医学工程领域的一些常规操作，诸如单个游离细胞体的捕获以及释放，细胞

注射或细胞组分提取等，还要求能够对细胞的相关参数进行测量与记录。因此对

于单个细胞的高速识别、精确捕获等技术都是至关重要的，这些技术同样也能应

用于细胞层面的治疗技术。单细胞捕获技术在众多前沿领域具有广泛应用前景，

这些前沿领域涵盖了干细胞、肿瘤、神经、生殖、微生物学等。

捕获并分析不同的单细胞如 T细胞、肿瘤细胞以及凋亡细胞等这类和人体健

康密切关联的单细胞在各种药物临床和疾病的诊断等应用中的重要性日益提高。

以癌症的产生为例，单个癌变细胞的突变以及增殖积累造成了肿瘤的产生，而肿

瘤组织里的肿瘤细胞往往并不处于同一发病阶段，单个肿瘤干细胞的有效分离和

培养在肿瘤干细胞发生的分子机制、侵袭和转移、肿瘤干细胞的靶向治疗以及与

微环境的相互作用等研究中具有更有意义的结果，也是需要迫切解决的难题之一。

对于尺度只有数微米的细胞的捕获，最关键的技术难题是捕获工具在细胞附

近的调整精度，这一操作的精度分辨率要求在几十纳米。面对这一要求，显微操

作仪应运而生，而目前的显微操作仪大多数还是手动的。现有的手动操作仪存在

诸多的弊端，高精度的操作要求操作员具有相当的技术水平，并且传统的目视操

作容易使操作员产生疲劳。以上原因使得操作的效率以及被操作细胞的成活率都

上海理工大学硕士学位论文

很低下。针对医用领域的细胞操作的情况是，医院每天需要处理的样本数量巨大，

医务操作人员的工作量巨大，工作效率低。按照目前的情况，自动细胞操作系统

比较少，而且非常昂贵，因此大多数的显微操作的完成依然依赖医务人员使用手

动控制操作仪实现。

当前市场上成熟的商业微操作系统大部分份额已被日本的尼康、德国的

Eppendorf 以及徕卡等公司占有。常用显微操作系统的基本组成为显微镜以及具

有定位、注射和夹持固定等功能的微操作仪。商业化的微操作系统价格昂贵，无

法大量普及，比如 Leica 公司的 LMD7000 激光显微操作系统需要 220 万元。因

而目前市场上对于开发出具有低成本，高自动化等特点的显微操作系统具有急切

的需求。上海中山医院与本课题组建立了合作关系，依托于上海中山医院的需求，

本课题拟建立一套简捷全自动高效的单细胞捕获系统，为相关研究提供技术支持。

在本课题中，我们研究并开发了由微平移台、长行程的精密轴以及图像识别

系统共同驱动的全自动单细胞捕获系统，该系统适用于大部分普通显微镜，它可

以广泛应用于单细胞捕获、操作，可应用于医院以及研究机构的单细胞捕获、培

养、分析等，可以大大降低研究人员的工作量和人工操作造成的失误率，工作的

效率也大幅提高。

1.1.2 研究意义

现有的显微操作手段主要是人工利用毛细吸管和显微镜等器械来对微小对象

进行显微操作来完成的。熟练操作员的培养需要付出大量的时间和经费，众多操

作的移动尺度在微米级甚至纳米量级。即使是经验丰富的操作员在显微镜下进行

此类的操作亦需要使用较长的时间，并且长时间操作会造成疲劳，从而使操作失

误率提高。受限于操作员技术掌握程度以和人体自身生理的极限，人工操作水平

仍停留于外形体积较大的对象。并且受制于技术水平，人工操作后的对象性质不

均一，以上诸多弊端都阻碍了微操作系统技术产业化进程。拥有自动化技术的显

微操作系统能够大幅提高相关细胞操作的效率，同时降低实验中人员操作难度，

因此此系统的研制具有至关重要的学术意义以及广阔的应用前景。所以通过机器

替代人员，以机器视觉替代肉眼，以自动化代替传统的手动操作，将推动生物工

程中显微操作技术向标准化、自动化、简单化的方向发展，这也在降低成本、提

高效率方面具有重要的研究意义。

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摘要在医学工程领域，需要在显微镜下对许多微小的生物细胞操作，比如快速识别、分选、捕获细胞。现行的大多数操作还是人工操作，效率低。由于全自动显微操作系统大多数为进口，价格昂贵，无法普及使用。本文围绕显微操作的自动化和智能化的主题，设计了基于荧光显微镜的用于识别捕获红细胞的计算机控制的自动化显微操作系统，该系统相对于进口系统成本较低，并且利用光机电技术结合实现稳定性好、可重复性高的自动化细胞操作。本文主要针对生物倒置显微镜结合的成像原理，根据显微操作系统的结构和特点，对各个部件进行选型，选择合适的机械定位系统和显微视觉系统，将各部件及其驱动器连接到正确端口构建自动化显微操作系统。其次，本文还研究了...

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