差示扫描量热法用于优化红细胞低温保存方案的研究

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3.0 侯斌 2024-11-19 5 4 3.04MB 70 页 15积分

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摘要

红细胞的长期保存可以解决日趋严重的红细胞供需矛盾。目前，低温保存是

延长红细胞保存期限的有效方法，但是冻结和复温过程会造成红细胞的损伤甚至

死亡，影响红细胞保存的回收率。为了优化红细胞的低温保存方案，研究人员常

改变保存液成分、降温速度、冷冻温度等因素进行重复试验，借助生化检测筛选

出回收率最高的方案，过程耗时又繁琐。另一方面，理论研究表明了解细胞膜的

渗透性质，掌握胞内水分跨膜迁移过程，了解细胞在低温环境中的应激反应，对

细胞低温保存方案的设计和优化有重要指导意义。

本研究从红细胞膜的渗透性质入手，采用差示扫描量热技术（differential

scanning calorimetry, DSC），根据细胞在降温过程中的放热量来评估其在特定低温

保护剂中的体积变化，确定细胞在不同溶液中对水的渗透参数，随后根据水分跨

膜转运模型推算细胞失水状况，由此预测细胞在特定保存液中的最佳降温速度，

优化红细胞的低温保存方案，大幅减少了工作量。主要研究工作如下：

采用差示扫描量热法测定红细胞在 0.9 % NaCl 等渗溶液中以 5℃/min 降温时

的放热量，借助放热量与细胞体积的线性关系，刻画细胞在低温环境中的体积变

化，依托水分跨膜转运的数理模型，通过数值拟合确定其在正常生理条件下对水

的渗透参数，即 Lpg 为0.1032 μm/min-atm，ELp 为82.59 kcal/mol (R2=0.936)，这与

先期 Han 的测定结果相近。

同样方法测定红细胞在渗透性保护剂中对水的渗透参数，红细胞在 20 % 二甲

基亚砜（DMSO）中，其 Lpg[cpa]为0.0173 μm/min-atm，ELp[cpa]为16.49 kcal/mol

(R2=0.913)；在 20 % 甘油中 Lpg[cpa]为0.0185 μm/min-atm，ELp[cpa]为23.02 kcal/mol

(R2=0.987)；在 10 % 甘油中 Lpg[cpa]为0.0111 μm/min-atm，ELp[cpa]为19.99 kcal/mol

(R2=0.960)。其数值上低于细胞在等渗溶液的相应值，由此看出渗透性保护剂的添

加能够增进细胞在低温环境中的持水能力，有效地遏制胞内水分在温度急剧下降

过程中流失速率。

将上述参数代入细胞水分跨膜转运的数理模型中，模拟在不同速度降温过程

中细胞失水情况，依据细胞束缚水含量推算其对应的最佳冷冻速度，细胞在 20 %

DMSO 中，其最佳降温速度为 37 ℃/min，而在 10 % 甘油及 20 % 甘油中则分别

为78 ℃/min 和44 ℃/min。

利用低温显微镜观察细胞以 5℃/min 降温时的形态变化，实验表明：细胞在

0.9 % NaCl 中，随着温度逐步下降而不断缩小，直至完全溶血消失。渗透性保护

剂的添加（20 % DMSO、10 % 甘油及 20 % 甘油）能延缓胞内水分流失，但 DMSO

会使细胞表面出现棘突，甘油在维持细胞形态上效果优于 DMSO。

将载有低温保护剂的细胞悬液以 20 ℃/min、40 ℃/min、60 ℃/min、80 ℃/min、

100 ℃/min 冷冻，根据红细胞回收率及血红蛋白回收率来考量保存效果。结果显示：

细胞在 20 % DMSO 中以 40 ℃/min 降温，细胞回收率及血红蛋白回收率达到最高，

分别为 63.31±1.05 %及80.41±3.07 %；10 % 甘油则是在 80 ℃/min 速度降温时保存

效果最佳，红细胞回收率及血红蛋白回收率分别达到 71.72±3.18 % 及

91.10±4.29 %；当甘油浓度提高至 20 %时，细胞的最佳降温速度为 40 ℃/min，对

应的红细胞回收率及血红蛋白回收率分别为 73.60±2.24 %及93.47±5.44 %。冷冻解

冻去甘油红细胞的甘油含量符合质量要求（＜10 g/L）。

实验结果与先前 DSC 热分析法给出的预测值相比较为接近，验证了用 DSC 热

分析法预测细胞在不同溶液中最佳降温速度的准确性，该方法对于设计优化红细

胞低温保存程序起到重要的指导意义。

关键词：红细胞差示扫描量热法水分迁移最佳冷冻速度

ABSTRACT

Long-term storage of red blood cells (RBCs) ensures a readily available supply for

clinical demand. Nowadays, cryopreservation can extend storage periods. However,

damages occur during freezing and thawing, reducing RBC viability. Therefore, a lot of

improvements in media, cooling rates and temperatures were carried out for

optimization of cryopreservation with tedious examinations. On the other hand,

measurements on water transport (membrane permeability) characteristics can predict

the biophysical response of cells during freezing, which is a promising approach for

optimization of cryopreservation protocol.

In our study, volume shrinkage during freezing RBCs can be obtained by using a

shape-independent differential scanning calorimeter (DSC) technique. By ﬁtting the

water transport model to the experimentally obtained DSC data, the best-ﬁt membrane

permeability parameters (reference membrane permeability to water, Lpg and the

activation energy, ELp) were determined. Afterwards, optimal cooling rates can be

figured out from theoretical model, dramatically reducing the experiments.

Cell suspensions were frozen to -50 ℃at a slow cooling rate (5 ℃/min) in the

presence of extracellular ice and 4 different media, 0.9 % NaCl, 20 % dimethyl

sulfoxide (DMSO), 10 % and 20 % glycerol. The combined best-fit paramters of water

transport in 0.9 % NaCl were Lpg=0.1032 μm/min-atm and ELp=82.59 kcal/mol with a

goodness-of-fit parameters R2=0.936, in agreement with Han’s report.

The corresponding parameters in 20 % DMSO were Lpg[cpa]=0.0173 μm/min-atm

and ELp[cpa]=16.49 kcal/mol with R2=0.913. Those in 10 % glycerol were

Lpg[cpa]=0.0111 μm/min-atm and ELp[cpa]=19.99 kcal/mol with R2=0.960, while those

in 20 % glycerol were Lpg[cpa]=0.0185 μm/min-atm and ELp[cpa]=23.02 kcal/mol with

R2=0.987. The membrane permeability decreased with the introduction of CPAs,

preventing osmotic lysis of RBCs.

By incorporating these membrane permeability parameters in water transport

model, optimal cooling rate for erythrocytes were ~37 ℃/min, ~78 ℃/min and

~44 ℃/min in the 20 % DMSO, 10 % and 20 % glycerol respectively.

Cell morphology were examined in various media at a cooling rate of 5 ℃/min by

cryomicroscopy. Cell volume declined with the decreasing temperature in 0.9 % NaCl

until lysis. After the introduction of permeating agents, RBCs retained intact membrane

and reasonable shape. Addition of DMSO resulted in spinous cells, implying glycerol

exerted a superior protection during biopreservation.

As an independent test of this prediction, cell and hemoglobin recovery rates were

obtained after freezing at 5 different cooling rates (20 ℃/min, 40 ℃/min, 60 ℃/min,

80 ℃/min and 100 ℃/min) in the CPA media. When RBCs were frozen in 20 % DMSO

at 40 ℃/min, the maximal cell and hemoglobin recovery rates reached 63.31±1.05 %

and 80.41±3.07 %. When RBCs were frozen in 10 % glycerol at 80 ℃/min, the

maximal cell and hemoglobin recovery rates reached 71.72±3.18 % and 91.10±4.29 %

respectively. Optimal cooling rate reduced to 40 ℃/min in 20 % glycerol, the maximal

cell and hemoglobin recovery were 73.60±2.24 % and 93.47±5.44 %. These theoretical

cooling rates were found to be in close conformity with experimentally determined

values.

Key Word：red blood cell, DSC, water transport, optimal cooling rate

中文摘要

ABSTRACT

第一章绪论 .................................................... 1

§1.1 红细胞概述 ................................................ 1

§1.1.1 红细胞的结构及功能 .....................................1

§1.1.2 红细胞输注 .............................................1

§1.2 红细胞的保存现状 .......................................... 2

§1.2.1 4 ℃低温保存 ...........................................2

§1.2.2 深低温保存 .............................................3

§1.2.3 玻璃化保存 .............................................4

§1.2.4 改善红细胞保存的研究进展 ...............................4

§1.3 红细胞低温损伤的热学机理 .................................. 5

§1.3.1 传热强于传质的过程 .....................................5

§1.3.2 传质强于传热的过程 .....................................5

§1.4 细胞的渗透现象 ............................................ 6

§1.4.1 渗透现象 ...............................................6

§1.4.2 渗透作用引发的低温损伤 .................................6

§1.4.3 细胞膜渗透特性的测量方法 ...............................7

§1.5 差示扫描量热法在细胞保存中的应用 .......................... 7

§1.5.1 功率补偿型 DSC 技术的工作机理 ...........................7

§1.5.2 差示扫描量热法在细胞保存上的应用 .......................8

§1.6 研究任务 ................................................. 11

第二章红细胞在等渗溶液中对水分渗透性质的研究 .................... 13

§2.1 细胞膜的渗透现象 ......................................... 13

§2.1.1 细胞在渗透压作用下的体积变化 ..........................13

§2.1.2 水分跨膜转运的数理模型 ................................13

§2.1.3 细胞体积变化的测定方法 ................................15

§2.2 DSC 测定细胞体积变化的原理 ................................ 15

§2.3 测定红细胞的非渗透性体积 ................................. 18

§2.3.1 材料与方法 ............................................18

§2.3.2 实验结果 ..............................................19

一．红细胞的等渗体积（V0） ..................................... 19

二. 红细胞在不同溶液中的体积变化 ...............................19

三．确定红细胞非渗透性体积（Vb） ............................... 20

§2.4 DSC 测定红细胞在等渗溶液中的渗透参数 ...................... 21

§2.4.1 材料与方法 ............................................21

§2.4.2 实验结果 ..............................................24

一．细胞悬液的热流曲线 .........................................24

二．计算细胞体积变化 ...........................................24

三．确定红细胞的渗透参数（Lpg 及 ELp） ............................ 26

§2.5 讨论 ..................................................... 26

§2.6 本章小结 ................................................. 27

第三章红细胞在渗透性保护剂中对水分渗透性质的研究 ................ 28

§3.1 渗透性保护剂的保护机制 ................................... 28

§3.2 测定红细胞在渗透性保护剂中对水分的渗透参数 ............... 29

§3.2.1 实验步骤 ..............................................29

§3.3.2 实验结果与讨论 ........................................30

一．测定保存液的熔融温度 .......................................30

二．细胞在不同溶液中的热流曲线 .................................31

三．细胞在不同溶液中的体积变化 .................................33

四．红细胞在不同保存液中的渗透参数 .............................34

五．确定最佳降温速度理论值 .....................................36

§3.3 本章小结 ................................................. 38

第四章红细胞在不同保存液中的低温保存实验 ........................40

§4.1 最佳降温速度 ............................................. 40

§4.2 在不同保存液中冷冻红细胞的形态观察 ....................... 41

§4.2.1 材料与方法 ............................................41

§4.2.2 实验结果与讨论 ........................................43

§4.3 红细胞在不同保存液中的最佳降温速度 ....................... 47

§4.3.1 材料与方法 ............................................47

§4.3.2 实验结果与讨论 ........................................49

一．测定细胞悬液未冻前的参数 ...................................49

二．测定细胞在不同降温速度下冻结融解后的参数 ...................50

三．测定细胞悬液中的甘油含量 ...................................50

§4.4 本章小结 ................................................. 50

第五章结论与展望 ................................................ 54

§5.1 主要结论 ................................................. 54

§5.2 展望及建议 ............................................... 55

参考文献 .......................................................... 57

在读期间公开发表的论文和承担科研项目及取得成果 .................... 64

致谢 ............................................................ 65

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摘要：

摘要红细胞的长期保存可以解决日趋严重的红细胞供需矛盾。目前，低温保存是延长红细胞保存期限的有效方法，但是冻结和复温过程会造成红细胞的损伤甚至死亡，影响红细胞保存的回收率。为了优化红细胞的低温保存方案，研究人员常改变保存液成分、降温速度、冷冻温度等因素进行重复试验，借助生化检测筛选出回收率最高的方案，过程耗时又繁琐。另一方面，理论研究表明了解细胞膜的渗透性质，掌握胞内水分跨膜迁移过程，了解细胞在低温环境中的应激反应，对细胞低温保存方案的设计和优化有重要指导意义。本研究从红细胞膜的渗透性质入手，采用差示扫描量热技术（differentialscanningcalorimetry,DSC），根据细胞...

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