激光扫描共聚焦显微成像系统中照明方式及控制方法研究

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3.0 牛悦 2024-11-19 7 4 1.3MB 55 页 15积分

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摘要

纳米技术、生物技术、高端集成电路制造技术是世界科学技术发展的重要方

向。而快速可靠的纳米级分辨率检测技术在纳米科学技术、生物技术、高端集成

电路制造等领域的研究中扮演着极其重要的角色，是不可或缺的必备研究仪器，

已经得到了世界各国及科学家的高度重视。由于具有非接触、无损伤、可探测样

品内部的特点，激光扫描共焦显微成像技术是一种极其重要的纳米分辨检测手段。

本课题的目的在于针对原有光学显微镜分辨率的不足，难以应用于纳米领域的检

测，提出了实现纳米分辨激光扫描共焦显微成像方法和实验系统，为纳米科学、

生物科学、高端集成电路的领域提供一种新型的纳米级远场光学检测技术。因此

本课题研究的内容包括硬件控制和软件平台的搭建两部分，其中硬件控制方面我

们采用被测样品移动，共焦系统不动的方案，被测样品的移动是由纳米平台的移

动带动的。软件平台的搭建方面主要测试系统的软件平台搭建和编程，软件的结

构设计，与底层控制系统的模块化连接，实用性强、操作便捷、界面友好的软件

操作界面设计和实现。同时，开展激光扫描共聚焦成像系统中照明方式研究，特

别是特殊矢量光束产生，及其对激光扫描共聚焦显微成像系统成像性能的影响。

在特殊矢量光束的产生实验中，提出了两种特殊矢量光束的产生方法，该方法中

用来产生特殊矢量光束的核心部件是由线偏振膜卷成的圆锥偏振膜。通常情况下

线偏振膜能够改变光束的偏振特性，将自然光转变为线偏振光，该圆锥偏振膜能

够直接将自然光转变为特殊矢量光束。

关键词：共焦显微镜照明方式控制方法

ABSTRACT

Nanotechnology, biotechnology, high-end integrated circuit manufacturing

technology is the important direction of development of science and technology. And

fast and reliable nano-scale resolution detection technology plays a very important

role in the nano science and technology, biotechnology, high-end integrated circuit

manufacturing industry, has got highly valued in the countries all over the world and

scientists. So, laser scanning confocal microscopic imaging technology is one kind of

extremely important nano scale resolution detection means because of its non-contact,

zero damage, and can detect the characteristics of the internal sample. And this

research subject contains two parts: hardware control and software platform. The

tested samples can move while the confocal system is fixed in the hardware control

project, and the movement of the tested samples is driven by the motion of the nano

platform. It contains test system software platform building and programming,

structure of software design, the module connection with the bottom control system,

and strong practice, convenient operation, friendly interface design and

implementation in the software project. At the same time, conducting the lighting

pattern research in the laser scanning confocal imaging system, especially special

vector beams producing, and the influence to the confocal laser scanning microscopy

imaging system. In the light production experiments of the special vector beams,

proposing one generation method of two kinds of special vector beam, and the core

component is cone polarizing film which is coiled by linear polarizing film. Linear

polarizing film can change the polarization characteristics of light, natural light can

be converted into linearly polarized light in general, while the cone polarizing film

can covert the natural light into special vector light directly.

Key Words: Confocal Microsope, Illumination Mode, Control Method

摘要

ABSTRACT

第一章绪论 .....................................................................................................................1

§1.1 照明方式和控制方法 ........................................................................................ 1

§1.2 研究显微成像系统中照明方式及控制方法的目的及意义 ............................ 3

第二章激光扫描共聚焦显微成像系统 .........................................................................4

§2.1 共聚焦显微成像系统特性及原理 .................................................................... 4

§2.2 几种激光扫描共焦显微镜照明方式比较 ........................................................ 6

§2.2.1 单光子激光扫描共焦显微镜 ...................................................................6

§2.2.2 双光子激光扫描共聚焦显微镜 ...............................................................7

§2.2.3 偏振共焦扫描显微镜 ...............................................................................9

§2.3 激光扫描共聚焦显微镜的应用 ...................................................................... 10

第三章几种光束产生方法介绍 ...................................................................................13

§3.1 概述 .................................................................................................................. 13

§3.2 非均匀分布特殊矢量光束 .............................................................................. 13

§3.2.1 产生原理 .................................................................................................14

§3.2.2 实验结果 .................................................................................................17

§3.2.3 结论 .........................................................................................................21

§3.3 柱对称矢量光束 ............................................................................................. 21

§3.3.1 产生原理 .................................................................................................22

§3.3.2 实验结果 .................................................................................................24

§3.3.3 结论 .........................................................................................................32

第四章系统运动控制方法 ...........................................................................................33

§4.1 系统与硬件介绍 ............................................................................................. 33

§4.2 系统软件设计 .................................................................................................. 35

§4.2.1 控制器初始设置 .....................................................................................35

§4.2.2 扫描速率设置 .........................................................................................39

§4.2.3 运动控制与实时显示 .............................................................................42

§4.2.4 扫描方式选择 .........................................................................................42

§4.2.4 扫描方式实现 .........................................................................................43

§4.3 结论 ................................................................................................................. 46

第五章总结与展望 .......................................................................................................47

§5.1 总结 ................................................................................................................. 47

§5.2 展望 ................................................................................................................. 48

参考文献 .........................................................................................................................49

在读期间公开发表的论文和承担科研项目及取得成果 .............................................52

致谢 .............................................................................................................................53

第一章绪论

§1.1 照明方式和控制方法

纳米技术和生物技术是世界科学技术发展的重要方向，而快速可靠地纳米级

分辨率检测技术在纳米科学和生物技术领域的研究中扮演着极其重要的角色，是

不可缺少的必备研究仪器，由于具有非接触、无损伤、可探测样品内部的特点，

激光扫描共聚焦显微成像技术是一种极其重要的高分辨检测手段。通常情况下，

激光扫描共聚焦显微成像系统由激光光源、共轭聚焦装置和设备、扫描模块、计

算机及数据采集和图像处理模块等组成，它是利用物镜使光束聚焦形成很小的光

点对样品逐点扫描成像，同时它采用了共轭焦点技术，使光源、被照射的物点还

有探测器处在彼此对应的共轭位置，这样光源经过物镜在样品表面聚焦形成衍射

限制的斑点，其反射光或者透射光再次通过物镜在共焦针孔平面成像，并且由靠

近像平面的探测器接受光信号，这样由于焦面以外的光信号在针孔前或者针孔后

成像，使得焦面以外的光信号被大大的抑制，极大地提高了激光共焦显微成像系

统的纵向分辨率。

根据 Abbe 理论，由于光学成像系统有限孔径的衍射，光学显微镜的横向和纵

向最小分辨率分别为t≈/(2nsin)=/(2NA)和z=2/(NA2)，其中、n、和NA

分别表示光波波长、介质折射率、显微镜的孔径角和数值孔径。因此提高显微镜

分辨率的传统方法就是提高数值孔径和减小照明波长。但是在实际的应用中照明

波长的选择往往取决于样品，不能任意减小，同时对 NA 的继续提高也已经没有

了余地。因此，传统的提高显微镜分辨率的方法已经走到了极致，必须寻找新的

突破口。

近年来，利用光波的矢量特性提高光学显微镜分辨率得到了显著发展。这是

因为高分辨率光学显微镜通常会采用大数值孔径的显微物镜，此时的光波的矢量

特性对焦斑影响非常显著。例如，采用 X 方向线偏振光照明，当物方最大半孔径

角很小时，电能量密度近似为圆对称分布，分辨率在 X 方向和 Y 方向上近似相等，

且都等于传动的光学分辨率。但是，随着物方最大半孔径角的继续增大，电能量

密度将失去圆对称性，且 X 轴方向上的分辨率大于传统的光学分辨率，Y 轴方向上

的分辨率小于传统的光学分辨率。当像方最大半孔径角比较大时，尽管物方的半

孔径角很小，电能量密度也不是圆对称分布的，并且 Y 方向上的分辨率始终大于 X

方向上的分辨率。当使用圆偏振光照明，在像方最大半孔径角很小时，物面上的

激光扫描共聚焦显微成像系统中照明方式及控制方法研究

分辨率可近似用传统分辨率公式计算，但是随着像方最大半孔径角的逐渐增大，

物面上分辨率明显小于传统分辨率。不过，当使用圆偏振光照明时，像面上的电

能量密度分布始终是圆对称的。因此，在高 NA 条件下，线偏振光聚焦为椭圆光

斑，在于入射光偏振态垂直的方向上获得更高的分辨率，但是成像系统的分辨率

取决于长轴方向上的分辨率。本激光扫描共聚焦显微成像系统采用两个正交的线

偏振光分别对扫描样品成像，通过两次焦斑短轴方向成像的数据重构超分辨率图

像，这种基于偏振差异成像系统的分辨率取决于短轴分辨率，由于短轴方向上的

分辨率高于长轴方向上的分辨率，更高于采用圆偏振光照明方式时的分辨率，因

此，采用偏振差异照明方式的激光扫描共聚焦显微成像系统的分辨率将得到明显

提高。

分析表明，光波的矢量特性是提高光学显微镜分辨率的一种有效的途径，特

别是特殊矢量光束在高数值孔径透镜聚焦时特殊的聚焦特性，如径向偏振光、

TM01

模激光、Bessel 光束等。研究表明径向偏振光能够产生比径向偏振光更小的聚焦光

斑，正是基于镜像偏振光的这一特性，它被用在高分辨率光学显微镜中。因此，

开展特殊矢量光束的产生方法研究是很有必要的。文中提出了产生两种特殊矢量

光束方法，该方法中用线偏振模卷成的圆锥偏振模是产生特殊矢量光束的关键部

件。在产生特殊矢量光束的光路中依次放置白光光源、透镜 1、透镜 2、扩束准直

镜、圆锥偏振膜、偏振片、透镜 3、图像采集模块。为了使光源的出射光束全部通

过透镜，提高光能的利用率，所以紧靠光源的出光孔放置透镜 1；为了产生平行光

束，进而垂直入射圆锥偏振模，紧靠透镜 1放置透镜 2；为了检验圆锥偏振模透射

光束的偏振特性，圆锥偏振膜放置偏振片，通过采集偏振片不同透光轴时的透射

光斑图样，分析图样的变化，便可以判断透射光束的偏振特性。

同该激光扫描共聚焦显微成像系统所采用的偏振差异成像照明方式相对应，

在扫描控制方面，采用梳妆波扫描方式。梳妆波扫描方式是指先让三维运动平台

只在 Y轴方向上运动一个步距的长度，然后按照原路径返回，再沿 X轴方向运动

一个步距长度，X方向和 Y方向上的步距长度可以不相等。在激光扫描共聚焦显

微成像系统中，利用声光偏转器分时偏振光束，在于 1/2 波片和侧向位移偏振棱镜

分时产生两束正交偏振光，实现线偏振光照明时的偏振差异成像。当产生光束为 X

方向上的线偏振光时，让三维运动平台沿 Y轴正方向运动一个步距的长度，当产

生光束为 Y方向上的线偏振光时让三维运动平台沿着原路径返回。这样，扫描方

式与该激光扫描共聚焦显微成像系统扫采用的偏振差异照明方式对应起来，实现

了偏振差异显微成像方法的扫描运动控制。

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摘要纳米技术、生物技术、高端集成电路制造技术是世界科学技术发展的重要方向。而快速可靠的纳米级分辨率检测技术在纳米科学技术、生物技术、高端集成电路制造等领域的研究中扮演着极其重要的角色，是不可或缺的必备研究仪器，已经得到了世界各国及科学家的高度重视。由于具有非接触、无损伤、可探测样品内部的特点，激光扫描共焦显微成像技术是一种极其重要的纳米分辨检测手段。本课题的目的在于针对原有光学显微镜分辨率的不足，难以应用于纳米领域的检测，提出了实现纳米分辨激光扫描共焦显微成像方法和实验系统，为纳米科学、生物科学、高端集成电路的领域提供一种新型的纳米级远场光学检测技术。因此本课题研究的内容包括硬件控制和软件平台...

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