壳聚糖三维多孔微载体 肝细胞复合体的构建与研究

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3.0 牛悦 2024-11-19 6 4 2.42MB 58 页 15积分
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摘 要
肝脏是人体代谢系统的中心器官，肩负着全身代谢、合成、分解、解毒、激
素灭活、凝血物质产生等多方面的功能。由于肝细胞的机能失调或者肝细胞的坏
死而导致肝脏丧失一种或多种功能的病症称为肝功能衰竭。虽然原位肝移植挽救
了许多末期肝病病人的生命，但因其费用高，技术复杂，供体肝严重短缺，即使
采用分肝肝移植仍供不应求，许多病人在等待肝移植的过程中死亡。
80 年代初，随着肝细胞分离、培养技术的日渐成熟，借鉴于人工肾技术，人
工肝(artificial liver, AL)技术得到迅速发展，从而为肝功能衰竭的患者等待肝移植或
自身肝再生争取了时间、创造了条件，为肝功能衰竭的治疗提供了新的方法。
本课题的目的是通过制备性能优良的三维多孔微载体来提高生物人工肝中肝
细胞的活性和密度，为提高肝功能衰竭的治疗效率打下基础，主要工作如下：
1. 以天然材料壳聚糖和多聚磷酸钠为原材料，利用二者所带的电荷相反的性质，
摒弃传统的乳化成球技术，改用高效便捷的高压脉冲微胶囊成型技术制备微
球，并结合冷冻干燥技术，经戊二醛交联处理即得目标微载体。
2. 通过光学显微镜、SEM 等对微载体的外观形态和三维结构进行表征，并对微
载体的孔结构、吸水性、孔隙率和生物降解性进行评价。研究结果表明，较传
统的乳化法制备的微载体，高压脉冲微胶囊成型技术制备的微球粒径可控、具
有良好的均匀性且能保持较高的圆整度。
3. 冷冻干燥后，微载体的形状基本保持不变，并且连通性好，孔隙率较高。另外，
在微载体表面增加胶原涂层，从而增加细胞的识别位点，提高细胞与载体之间
的相容性。
4. 以大鼠的肝脏为肝细胞供体，分离出形态好、存活率高的原代大鼠肝细胞。用
添加胎牛血清的 RPMI1640 培养液进行肝细胞的微载体培养，肝细胞在微载体
表面和内部均保持良好的球形状态，并且以聚集体的形式存在，从而大大提高
了肝细胞的密度和代谢活性。
综上所述，本课题通过高压脉冲微胶囊成型技术和冷冻干燥技术，制备了性
能较优的三维壳聚糖微载体，大鼠肝细胞能够在微载体内正常生长和分化。这为
生物人工肝的实际应用提供了技术支持。
关键词：肝细胞 壳聚糖 多聚磷酸钠 微载体 冷冻干燥 细胞培养 生
物人工肝
ABSTRACT
Liver is the center of the metabolic system, which has the function of metabolism,
synthesis, decomposition, detoxication, inactivation of hormone, coagulation substance
and so on. Owing to the disorder or necrosis of liver cells, the liver will lose one or
more function, which is called hepatic failure. Though orthotopic liver transplantation
can save lots of hospice liver patients, it also has the problem of high cost, technical
sophistication and limitation of donor. A great number of patients died when they were
waiting for the donor.
In the early 80’s, with the development of cell separation and culture technology,
artificial liver developed rapidly on the basis of artificial kidney. Artificial liver can buy
time for patients with hepatic failure .
The objective of this study was to prepare three dimensional multiporous
microcarriers with good character to increase the cell dnsity and metabolic activities of
hepatoctyes, and lay the foundation for cure rate of liver exhaustion with artificial liver
support system.
1. Using chitosan and sodium polyphosphate as raw materials, based on their reverse
electric charge, highly open porous biocompatible chitosan microcarriers with
suitable size and good function for artificial liver were fabricated by a high-voltage
electrostatic field technique and freeze drying, method using glutaraldehyde as
ligand, instead of the traditional emulsion method.
2. Optical microscopic and scanning electron microscopic observation showed that
evenly distributed and interconnected pore structures were formed in these
microcarriers. The surface pores became as large as 20μm in diameter with
increasing the pH of the sodium polyphosphate. In addition, swelling and
degradation studies showed that the microcarriers have both excellent properties of
hydrophilicity and biodegradability.
3. After the process of freeze drying, the diameter of the microcarriers are smaller
then the microspheres. In addition, the chitosan microcarriers coated with collagen
had more recognition site, and then increase the compatibility between hepatoctyes
and chitosan microcarriers.
4. High yield rate, good morphological and high viability of hepatocytes were isolated
from rat liver donor. Rat hepatocytes were cultured on the chitosan microcarriers,
suspended in the RPMI1640 nutrient solution with fetal calf serum. Experiment
result showed that a kind of tissue structure like canaliculus was formed in the
microcarriers, which greatly enhanced the metabolic function and cell density of
hepatocytes.
In conclusion, three dimensional porous chitosan microcarriers have been made by
high voltage electrostatic field technique and freeze drying. Rat liver cells can live and
differentiate normally in the microcarriers, which provide technical support for artificial
liver application.
Key Word: Hepatocytes, Chitosan, Sodium polyphosate, Microcarrier,
Freeze drying, Artificial liver
目 录
摘 要
ABSTRACT
第一章 绪 论 ..................................................... 1
§1.1 肝脏结构及功能 .......................................... 1
§1.1.1 肝脏的结构 ........................................... 1
§1.1.2 肝脏的功能 ........................................... 1
§1.2 生物人工肝的研究进展 .................................... 3
§1.3 细胞培养技术概述 ........................................ 7
§1.4 微载体细胞培养技术 ...................................... 9
§1.5 目前研究热点与立题意义 ................................. 14
§1.6 研究内容 ............................................... 14
第二章 壳聚糖三维多孔微载体的构建及性能表征 ..................... 16
§2.1 壳聚糖三维多孔微载体的构建 ............................. 16
§2.1.1 壳聚糖 .............................................. 16
§2.1.2 微载体制备技术 ...................................... 17
§2.1.3 实验仪器与材料 ...................................... 20
§2.1.4 实验方法 ............................................ 24
§2.2 壳聚糖三维多孔微载体的性能表征 ......................... 34
§2.3 结果与分析 ............................................. 35
§2.3.1 壳聚糖微载体制备的影响因素分析 ...................... 35
§2.3.2 壳聚糖微载体的性能表征 .............................. 39
§2.4 本章总结 ............................................... 41
第三章 三维多孔微载体/肝细胞复合体的构建及生物学特性检测 ........ 42
§3.1 壳聚糖三维多孔微载体/肝细胞复合体的构建 ................ 42
§3.2 壳聚糖微载体/肝细胞复合体的生物学特性检测 .............. 45
§3.3 结果与分析 ............................................. 46
§3.4 本章总结 ............................................... 48
第四章 结论与展望 ............................................... 49
§4.1 研究结论 ............................................... 49
§4.2 展望 ................................................... 50
参考文献 ........................................................ 51
在读期间公开发表的论文和承担科研项目及取得成果 .................. 55
致 谢 ........................................................... 56
第一章 绪 论
1
第一章 绪 论
§1.1 肝脏结构及功能
人体中肝脏是最大的腺体。成人的肝脏重约 1500g。肝脏既可以作为一个分泌
胆汁的外分泌腺，通过胆道系统把胆汁输入十二指肠，也可作为合成多种物质的
内分泌腺，直接释放到血液。在肝脏中发生的化学反应超过 500 种，其具有生物
代谢、解毒、免疫等功能。有实验表明，动物在完全摘除肝脏后，即使给予相应
的治疗，最多也只能生存 50 多个小时，由此说明，肝脏是维持生命活动的一个必
不可少的重要器官。
§1.1.1 肝脏的结构
如图 1-1 所示[1]，肝脏由呈板状排列的上皮细胞构成，肝板呈放射状排列，以
肝静脉的终末分枝为中心并互相连接形成连续的立体结构。放射状排列的肝板两
侧与平行的血管系统及肝窦内的血液相接触。放射状的窦状隙与肝板的广阔表面
密切接触，并经肝窦的窗孔相互沟通，形成薄壁血管迷路系统，该系统与肝实质
的表面区域紧密相关。
肝细胞[2]直径为 20~30μm，体积为 4900μm3，表面积为 1700μm2。其呈多面形，
有六个或六个以上的面。肝细胞表面有三种：暴露于窦状隙周围间隙的面、暴露
于毛细胆管的面、与毗邻肝细胞接触的面。肝细胞的细胞核大且圆，表面光滑，
其大小因细胞而异，并且大小差别可用多倍性表示。大多数肝细胞只有一个核，
但25%的细胞有两个核。70%或更多的肝细胞核为四倍体，1-2%的肝细胞胞核为
八倍体。肝细胞核为典型的泡状，有少数呈散状分布的染色质团块，核仁明显，
呈一个或多个。其细胞质呈现高度可变的外观，这在一定程度反映出细胞的功能
状态。细胞质主要的变动是储存物质及糖原和脂肪的含量。线粒体、高尔基体、
溶酶体、内质网、过氧化物酶体等细胞器均在细胞质中可见。
§1.1.2 肝脏的功能
1. 生物代谢功能
肝脏在人的生命中具有非常重要的作用，几乎所有营养物质的代谢都需要肝
脏的参与。如碳水化合物的代谢、蛋白质的合成、氨基酸的代谢及尿素的合成、
脂类的代谢等。简述如下：
肝细胞从血液中摄取葡萄糖，经过一系列的酶反应，葡萄糖被转化成糖原储
存，并且通过糖酵解和糖异生的作用使血液中的葡萄糖保持稳定。在肝细胞的胞
质中游离着许多涉及糖原生成和分解的酶，具有代表性的为 6-磷酸葡萄糖酵解酶。
壳聚糖三维多孔微载体/肝细胞复合体的构建与研究
2
图1-1 肝脏结构示意图
80%的氨基酸在肝脏内进行蛋白质的合成。如血清白蛋白，甲种和乙种球蛋白，
血浆中的各种酶、糖蛋白及脂蛋白均在肝脏中合成。基于许多凝血因子以及凝血
酶原均由肝细胞合成，患肝病时可引起凝血时间延长和发生出血的可能。
肝脏内还可进行一大部分氨基酸的脱氨、转氨等作用。氨基酸的分解代谢可
产生氨并进入血液，血液中氨浓度的升高可引起中枢神经系统中毒，从而引起脑
功能障碍。体内清除氨主要通过以下三个途径实现：
1) 肝内尿素的合成：这是人体内解除氨毒性的主要途径。在肝细胞内一系列
酶的催化下，通过鸟氨酸循环将氨合成为相对无毒的尿素，再通过血液运
输并经肾脏排出体外；
2) 谷氨酰胺的合成：该代谢途径是在谷氨酰胺合成酶的催化下消耗 ATP 的一
种合成反应（图 1-2）；
图1-2 谷氨酰胺合成途径
3) 氨基酸的生成：在谷氨酸脱氢酶的作用下，细胞可将氨和а-酮戊二酸结合
生成谷氨酸。在各种转氨酶的作用下，生成的谷氨酸将氨基转移至其它а-
酮酸而生成相应的氨基酸，与此同时，谷氨酸转出氨基后生成的а-酮戊二
酸又重新与氨合成谷氨酸。循环进行，游离的氨被固定在各种酮酸上，从
而达到解除氨的毒性的目的。但因为在脑组织中，仅谷草转氨酶的活性较
摘要：

摘要肝脏是人体代谢系统的中心器官，肩负着全身代谢、合成、分解、解毒、激素灭活、凝血物质产生等多方面的功能。由于肝细胞的机能失调或者肝细胞的坏死而导致肝脏丧失一种或多种功能的病症称为肝功能衰竭。虽然原位肝移植挽救了许多末期肝病病人的生命，但因其费用高，技术复杂，供体肝严重短缺，即使采用分肝肝移植仍供不应求，许多病人在等待肝移植的过程中死亡。80年代初，随着肝细胞分离、培养技术的日渐成熟，借鉴于人工肾技术，人工肝(artificialliver,AL)技术得到迅速发展，从而为肝功能衰竭的患者等待肝移植或自身肝再生争取了时间、创造了条件，为肝功能衰竭的治疗提供了新的方法。本课题的目的是通过制备性能优...

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