微量热法研究10-23脱氧核酶切割反应

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3.0 赵德峰 2024-11-19 6 4 1.86MB 69 页 15积分

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摘要

10-23 脱氧核酶是利用体外分子进化技术筛选得到的一种具有催化功能的单

链DNA 片断，具有高效的催化活性及特异的序列识别能力，能催化 RNA 特定部

位的切割反应，抑制相应蛋白的表达。在抗肿瘤、抗病毒等基因治疗领域具有广

阔的应用前景，成为目前分子生物医学及新药开发等多种领域的热点。测定 10-23

脱氧核酶切割反应的动力学的方法主要放射性标记法、荧光法等。用微量热法研

究的报道比较少。本课题依据上述分析，选用乙型肝炎病毒（HBV）前区 C/C 区

2031 位点的序列作为底物 RNA 片段，并合成相应的 10-23 脱氧核酶，然后用微量

热法研究 10-23 脱氧核酶的热稳定性和热动力学，主要内容如下：

1近生理条件下 10-23 脱氧核酶的热动力学研究

在近生理条件下（37℃，pH7.5，2mM MɡCl2，150mM KCl），通过微量热法

测定 10-23 脱氧核酶切割反应的热动力学参数。根据热流曲线得出不同底物 RNA

浓度的反应初速率ν0=1.85×10-10mol·L-1·s-1；再做出 V-[S]曲线，通过 L-B 作图得出

10-23 脱氧核酶切割反应的酶反应动力学常数最大速率 Vmax 和米氏常数 Km 分别

为νmax=2.5×10-8 mol·L-1·s-1，0.47nM。并从分析测量误差的来源出发，发现可以控

制人员操作误差、体积计量器具误差，在一定程度上提高了实验结果的准确度。

通过控制每次试验开始前 DSC 基线稳定时间的一致性，相对标准误差由 14.71%下

降到 11.15%。因此基线稳定时间是影响测热结果的主要因素。

2反应体系组分对 10-23 脱氧核酶切割反应的影响

在非生理条件下，主要研究了酶及底物的浓度、金属阳离子、pH 对切割反应

的影响。（1）酶浓度在 0~30（nM）范围内，切割反应的初速度随着酶浓度的增大

而逐渐增大，最后趋向平缓。（2）底物浓度在 0~4（nM）内，切割反应的初速度

随着底物浓度的增大而逐渐增大，并趋向平缓。（3）在适宜的金属阳离子（Mɡ2+、

Ca2+、Mn2+）浓度范围内，切割反应的 Kcat 随着金属阳离子浓度增大而逐渐增大。

这三种离子的活性大小为 Mn2+> Mɡ2+、Ca2+

（4）当 pH>8.5 或者 pH<6 时，都能使

10-23 脱氧核酶的活性降低，Kcat 值降低。在 pH6~8.5 范围内，Kcat 值与 pH 值成线

性拟合关系。

3温度对 10-23 脱氧核酶切割反应的影响

微量热法研究温度对 10-23 脱氧核酶热稳定性的影响，并分析比较了溶液和粉

末两种状态的保存效果。研究表明：低温保存粉末状的 10-脱氧核酶的效果好，活

性保持良好，可以保存几个月以上。反应过程中温度对酶热稳定性的影响，研究

表明：当 T=37℃时，切割反应的 Kcat 值最大，活性最佳。在 25~37℃内，随着温

度的升高，表观催化常数逐渐增大；在 37~50℃内，表观催化常数随着温度的升高

而逐渐降低。在 37-50℃之间，发生的是可逆性酶失活，酶大分子表面构象偏离正

常状态，使催化效率下降。

关键词：乙型肝炎病毒 10-23 脱氧核酶量热法热稳定性热动力学

ABSTRACT

10-23 DNAzyme(10-23 DRz) is a set of single stranded DNA segments which

derived from a combinatorial library of sequences by molecular technique in vitro.

10-23 DRz have high catalytical activity and sequence specificity against the target

RNA, and they can designed to cleave any target RNA in a sequence specific manner,

and regular the expression of corresponding proteins, which has broad application

prospects In the anti-tumor, anti-virus field of gene therapy become the focus of

molecular biology and other medical and drug. In this paper, selected anterior HBV C /

C area 2031 points as sequence fragments of the substrate RNA, Synthesized the

corresponding 10-23 DNAzyme and studied the thermal stability and thermodynamics

of 10-23 DNAzyme. The main contents are as follows:

1 The thermal kinetics of 10-23 DNAzyme under simulated physiological

conditions

Under simulated physiological conditions (37℃，pH7.5，2mM MɡCl2，150mM

KCl), measured the thermodynamics of 10-23 DNAzyme by microcalorimetry. Heat

flow curves is obtained with different concentrations of substrate RNA, and The initial

reaction rate is ν0=1.85×10-10mol·L-1·s-1. The curves of V-[S] is draw. The maximum

rate of enzyme reaction and Km by Mapping L-B is that: νmax=2.5×10-8 mol·L-1·s-1,

Km=0.47nM. And by controlling all the factors influencing the measurement result, the

RSD(relative standard deviation) of the results could be reduced from14.71% to

11.15%.

2 The thermal kinetics of 10-23 DNAzyme under non-physiological conditions

The concentration of the enzyme and substrate, the metal cations and pH is studied

under non-physiological conditions.(1) In the 0 ~ 30 (nM) range of enzyme

concentration the initial rate of cleavage increases with the enzyme concentration

increases. (2) In the 0 ~ 4 (nM) range of substrate concentration the cleavage reaction of

the initial velocity with the increase of substrate concentration increases, and tends to

smooth. (3) In the appropriate concentration range of metal cation (Mɡ2+、Ca2+、Mn2+),

the Kcat of cleavage reaction increases with the concentration of metal ions increases.

The activity of the three ions as: Mn2+> Mɡ2+、Ca2+ (4) When pH> 8.5 or pH <6, this

can make the lower the activity of 10-23 DNAzyme, Kcat is decreased. In the range of

pH6 ~ 8.5, Kcat keep the fitting linear relationship with pH.

3 Microcalorimetric study on the thermal stability of the 10-23 DNAzyme

The thermal stability of 10-23 DNAzyme is affected under different temperatures by

microcalorimetric. And the two states solution and powder preservation are analyzed

and compared. The results showed that. The effect of cryopreservation of 10-23

DNAzyme is the best. When T = 37 ℃, the cleavage reaction of the Kcat is the biggest

and the best. In the 37 ~ 50 ℃, the apparent catalytic constant with temperature

increasing is decreased. In the 37 ~ 50 ℃, the reversible inactivation of enzymes is

made, and conformation of enzyme molecules deviate from the normal surface, finnaly

the efficiency of catalytic efficiency is decreased.

Key Words: HBV, 10-23DNAzyme, Microcalorimetric, Thermal

stability, Thermodynamics

中文摘要

ABSTRACT

第一章绪论 ........................................................ 1

§1.1 引言 ...................................................... 1

§1.2 10-23 脱氧核酶的研究进展 ................................... 1

§1.2.1 10-23DRz 的体外筛选 ................................... 1

§1.2.2 10-23DRz 的结构及耙位特征 ............................. 2

§1.2.3 10-23DRz 活性的影响因素 ............................... 2

§1.2.4 10-23DRz 的生物特性研究 ............................... 3

§1.2.5 10-23DRz 的应用现状 ................................... 4

§1.3 微量热技术在各个领域的应用进展 ............................ 7

§1.3.1 微量热技术在微生物研究中的应用 ....................... 7

§1.3.2 微量热技术在医学上的应用 ............................. 7

§1.3.3 微量热技术在酶活检测中的应用 ......................... 8

§1.4 本课题的来源及研究的主要内容 .............................. 8

§1.4.1 课题来源 ............................................. 8

§1.4.2 微量热技术在核酸类酶活性检测中存在的主要问题 ......... 9

§1.4.3 主要内容 ............................................. 9

§1.5 本章小结 ................................... 错误！未定义书签。

第二章微量热法测量 10-23 脱氧核酶切割反应 ......................... 10

§2.1 引言 ..................................................... 10

§2.2 酶切割反应的机理 ......................................... 10

§2.2.1 反应体系的选择 ...................................... 10

§2.2.2 酶切割反应机理 ...................................... 11

§2.3 材料与设备 ............................................... 12

§2.3.1 材料 ................................................ 12

§2.3.2 仪器与设备 .......................................... 12

§2.3.3 微量热计 Micro DSCIII 简介 ............................ 12

§2.4 试验方法 ................................................. 13

§2.4.1 试剂的配置 .......................................... 14

§2.4.2 10-23 脱氧核酶反应热的测定 ........................... 14

§2.4.3 实验误差对切割反应热测量结果的影响 .................. 17

§2.5 结果与讨论 ................................................18

§2.5.1 微量热法测量 10-23 脱氧核酶切割反应的反应热 .......... 18

§2.5.2 误差分析前的 10-23 脱氧核酶切割反应热的测定 .......... 20

§2.5.3 误差分析 ............................................ 20

§2.6 本章小结 ................................................. 22

第三章近生理条件下 10-23 脱氧核酶切割反应的热动力学 ............... 23

§3.1 引言 ..................................................... 23

§3.2 10-23 脱氧核酶切割反应热动力学参数的理论研究 .............. 23

§3.2.1 10-23 脱氧核酶反应速度方程 ........................... 23

§3.2.2 10-23 脱氧核酶吸热速度方程 ........................... 24

§3.3 材料与设备 ............................................... 25

§3.3.1 材料 ................................................ 25

§3.3.2 仪器与设备 .......................................... 25

§3.4 试验方法 ................................................. 26

§3.4.1 近生理缓冲体系的成分 ................................ 26

§3.4.2 量热法测定 10-23 脱氧核酶切割反应热 .................. 26

§3.5 结果与讨论 ............................................... 26

§3.5.1 10-23 脱氧核酶切割反应的初始吸热速率 ................. 26

§3.5.2 10-23 脱氧核酶切割反应的动力学参数 ................... 27

§3.6 本章小结 ................................................. 28

第四章反应组分变化对 10-23 脱氧核酶切割反应的影响 ................. 29

§4.1 引言 ..................................................... 29

§4.2 反应体系的组分及其作用 ................................... 29

§4.2.1 10-23 脱氧核酶 ....................................... 29

§4.2.2 底物 RNA 片段 .........................................30

§4.2.3 金属阳离子 ...........................................30

§4.2.4 反应体系的 pH ........................................31

§4.3 材料与设备 ............................................... 31

§4.3.1 材料 .................................................31

§4.3.2 仪器与设备 ...........................................31

§4.4 试验方法 ................................................. 32

§4.4.1 量热法测定不同酶浓度下的切割反应 .....................32

§4.4.2 量热法测定不同底物浓度下的切割反应 .................. 33

§4.4.3 量热法测定不同金属阳离子浓度下的切割反应 ............ 34

§4.4.4 量热法测定不同 pH 条件下的切割反应 ...................36

§4.5 结果与讨论 ............................................... 37

§4.5.1 量热法测定不同酶浓度下切割反应的初始反应速度 ........ 37

§4.5.2 量热法测定不同底物浓度下切割反应的初始反应速度 ...... 37

§4.5.3 量热法测定不同金属阳离子浓度下切割反应的表观催化常数 39

§4.5.4 量热法测定不同 pH 下切割反应的表观催化常数 ........... 41

§4.6 本章小结 ................................................. 42

第五章温度对 10-23 脱氧核酶切割反应的影响 ......................... 44

§5.1 引言 ..................................................... 44

§5.2 材料与设备 ............................................... 44

§5.2.1 材料 ................................................ 44

§5.2.2 仪器与设备 .......................................... 44

§5.2.3 差示扫描量热仪简介 .................................. 45

§5.3 试验方法 ................................................. 47

§5.3.1 10-23 脱氧核酶反应体系的配置 ......................... 47

§5.3.2 10-23 脱氧核酶水溶液 DSC 测定 ......................... 47

§5.3.3 保存温度对 10-23 脱氧核酶热稳定性的影响 .............. 48

§5.3.4 反应温度对 10-23 脱氧核酶热稳定性的影响 .............. 49

§5.4 结果与讨论 ............................................... 49

§5.4.1 10-23 脱氧核酶水溶液 DSC 曲线 ........................ 49

§5.4.2 保存温度对 10-23 脱氧核酶热稳定性的影响 .............. 50

§5.4.3 反应温度对 10-23 脱氧核酶热稳定性的影响 .............. 53

§5.5 结果与讨论 ............................................... 54

第六章结论与展望 ................................................. 55

§6.1 结论 ......................................................55

§6.2 展望与建议 ................................................56

参考文献 .......................................................... 57

在读研期间公开发表的论文和承担科研项目及取得成果 .................. 63

致谢 .............................................................. 64

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摘要10-23脱氧核酶是利用体外分子进化技术筛选得到的一种具有催化功能的单链DNA片断，具有高效的催化活性及特异的序列识别能力，能催化RNA特定部位的切割反应，抑制相应蛋白的表达。在抗肿瘤、抗病毒等基因治疗领域具有广阔的应用前景，成为目前分子生物医学及新药开发等多种领域的热点。测定10-23脱氧核酶切割反应的动力学的方法主要放射性标记法、荧光法等。用微量热法研究的报道比较少。本课题依据上述分析，选用乙型肝炎病毒（HBV）前区C/C区2031位点的序列作为底物RNA片段，并合成相应的10-23脱氧核酶，然后用微量热法研究10-23脱氧核酶的热稳定性和热动力学，主要内容如下：1近生理条件下10-2...

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